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探究一种高效快速便捷地提取菌体DNA的方法
 
更新日期:2019-01-24   来源:食品科技   浏览次数:92   在线投稿
 
 

核心提示:在世界范围内,每年有超过30%的人口患食源性疾病,造成数十亿美元的花销[1]。随着经济全球化进程的加快,食品安全问题已成为当今世界公共卫生部门研究

 
 在世界范围内,每年有超过30%的人口患食源性疾病,造成数十亿美元的花销[1]。随着经济全球化进程的加快,食品安全问题已成为当今世界公共卫生部门研究的热点[2]。而金黄色葡萄球菌是一种常见的致病菌,据美国疾病控制中心报告,由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒仅次于大肠埃希氏菌,居第二位,占细菌性食物中毒的33 %[3]。中国每年有24万人患病,其中有1000人住院,6人死于葡萄球菌食物中毒[4]。因此,金黄色葡萄球菌检测是中国食品安全检测的常规项目之一(中国国家食品安全标准GB 4789.10-2010)。
目前对致病菌的检测中传统分离鉴定方法准确性较高,但步骤繁琐、耗时耗力[5];免疫学检测周期短,但灵敏度较差[6,7];PCR的方法检测时间短、灵敏性高,但需要电泳检测,增加了污染的风险[8,9];LAMP检测方法便捷快速,但是极易产生气溶胶污染[10]。荧光定量PCR技术是最高效的种类鉴定方法之一,具有高特异性、高检测效率、低污染等优点[11]。但是由于DNA提取过程复杂,耗时长,严重阻碍了各种检测方法的发展。因此,一种简单、有效、快速、低成本的DNA提取方法将大大缩短检测的时间,并会扩大各检测方法的实际应用。已有研究报道DNA模板(在PCR或LAMP检测分析中)的成功提取应用,方法是简单地将标本煮沸[12,13]。本实验基于前人的报道,拟采用热裂解过柱法提取DNA,只需煮沸和过柱离心,不需要添加各种酶和试剂,减少了操作步骤,降低了提取成本。本研究针对金黄色葡萄球菌的nuc基因[14,15]对菌液培养物和人工污染鱼样品分别采取热裂解过柱法、试剂盒法和直接热裂法提取DNA,进行荧光定量PCR检测,确定DNA提取效果。
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株、培养基与试剂
金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)、大肠杆菌(ATCC 25922)、沙门氏菌(ATCC 15611)、单增李斯特菌(ATCC 19112)、福氏志贺氏菌(ATCC 12022)、副溶血性弧菌(ATCC 17802)购于广东省微生物研究所和北京北纳生物公司。营养肉汤培养基 NB、平板计数培养基 PCA (青岛海博生物技术有限公司);琼脂糖(西班牙进口分装);ExRed核酸染色液(北京庄盟试剂公司);DNA Marker(大连Takara生物公司);PCR扩增试剂、基因组DNA小量提取试剂盒、SYBER Green Ex Taq(2x)(TakaRa宝成试剂有限公司);荧光定量PCR八连管(平盖)(美国Bio-Rad公司)。
1.1.2样品
本研究中使用的鱼及样品均是从杭州教工路物美超市购买,并保持4℃运回实验室。样品:鳊鱼,鸡肉,猪肉,带鱼,榨菜,甲鱼,蛋糕,鸭蛋,鹌鹑蛋,馒头,年糕,火腿,骨肉相连,豆腐,黄金糕,生菜,莴苣,菠菜,西红柿。
1.1.3仪器与设备
荧光PCR仪、T100型PCR仪、Bio-rad 电泳仪、凝胶电泳仪均由美国Bio-Rad公司生产,BSA124S-CW电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)、RC-6 Plus高速冷冻离心机(美国Thermo公司)、Mili-O超纯水机Gradient型(美国GRANT公司)、漩涡振荡器(海门其林贝儿仪器制造有限公司)、LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)、Ultra-Turrax T18 basic均质机(德国IKA公司)、双层立式冰箱(海尔公司)、SW-CJ-IFD洁净工作台(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)。
1.2方法
1.2.1 金黄色葡萄球菌的培养
将实验室保存的金黄色葡萄球菌,挑选单菌落在NB培养基上进行活化,并在PCA 培养基上涂布培养,进行平板计数。
1.2.2 样品前处理
人工污染鱼肉样品:取鳊鱼背部组织3 g,加入27 ml ddH2O,均质3 min。4℃,1000 r/min离心2分钟,吸取上清液作为检测样品。用试剂盒法提取DNA,并用qPCR进行检测。
在检测无金黄色葡萄球菌的均质液中,加入1.04×107cfu/ml的菌液,进行梯度稀释,使最终浓度范围在1.04×106~1.04 cfu/ml。然后4℃,1000 r/min离心2分钟,吸取上清液作为检测样。
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